ABC des techniques moléculaires

Mutagénèse

Les mutations permettent la création de nouvelles variétés...
À quoi ça sert ?
Les mutations conduisent à la création d'un nombre croissant de nouvelles variétés : plus de 2 000 variétés ont été créées à partir de mutations naturelles ou induites.
Comment ça marche ?
Beaucoup de mutations apparaissent naturellement. Si certaines sont létales, d'autres peuvent être mises à profit par l'obtenteur ou le producteur et de nouveaux produits apparaissent : nectarine, cerisier auto-fertile, chou-fleur, fruit de pamplemousse sans pépin ou à pulpe rose, etc.
En amélioration des espèces florales, fruitières ou maraîchères notamment, on peut avoir  recours à la mutation induite par le biais de diverses techniques pour en augmenter la fréquence : radiations ionisantes (source principale de création de mutants), mutagenèse chimique.

Tilling

Au laboratoire, il existe depuis peu une technique, appelée Tilling, perfectionnée à l’Inra (brevet 2004), qui permet de savoir si un gène auquel on s’intéresse a été muté lors d’expériences de mutation aléatoire, chimique par exemple. Le Tilling (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) permet le criblage à grande échelle de collections de mutants induits chimiquement (c'est-à-dire par l'utilisation d’un composé chimique mutagène, l’EMS, Ethyl méthanesulfonate) pour repérer des mutations dans un gène donné. Cette technique repose sur l’utilisation d’enzymes, les endonucléases, dont la fonction est de couper le génome à certains endroits bien précis. L’originalité du travail réalisé à INRAE est d’avoir réussi à sélectionner et à caractériser biochimiquement une endonucléase, appelée ENDO-1, spécifique des « misappariements » c’est-à-dire des mutations intervenues dans le génome.
Cette technique, à vocation cognitive,  permettra d’aller plus vite dans l’analyse des bases de données et l’identification des gènes d’intérêt agronomique, qui constitue le grand pari de cette décennie en biologie végétale.

Ecotilling

L'ecotilling permet de détecter des formes de gènes (allèles) encore inexploités en création variétale...
À quoi ça sert?
L'ecotilling permet de détecter des formes de gènes (allèles) encore inexploités en création variétale.
Notion d'allèle : les allèles sont des formes d'un même gène qui présentent entre elles de petites variations dans leurs séquence, variations qui se traduisent par la synthèse de protéines légèrement différentes. Cette propriété est à la base de la variabilité génétique.
Comment ça marche?
À partir d'informations précises sur un gène d'intérêt, issues des travaux de génomique, on recherche des allèles particuliers dans les collections de ressources génétiques. L'intérêt de cette technologie est de fournir des allèles originaux pour la sélection.

Sélection assistée par marqueurs

La sélection par marqueurs permet d'identifier les gènes transmis au cours des croisements...
À quoi ça sert ?
La sélection assistée par marqueurs permet de contrôler les croisements et de gagner un temps considérable.
Comment ça marche ?
Les marqueurs servent à repérer les gènes qui confèrent des caractères agronomiques intéressants, même si on ne connaît pas les gènes eux-même. Au fil des croisements successifs, il suffit de chercher la présence des marqueurs pour trier les descendants qui ont conservé les gènes intéressants, sans avoir besoin de les tester au champ. Cette technologie est maintenant généralisée dans les méthodes de sélection.
Les marqueurs sont des fragments d’ADN, faciles à repérer, situés à proximité des gènes d’intérêt et qui coségrègent avec eux au cours des croisements.

Transgenèse

À quoi ça sert ?
La transgenèse est une biotechnologie parmi les autres, si ce n’est qu’elle est particulièrement puissante et permet des applications nombreuses et variées. Elle fait l’objet de nombreux débats et de nombreux travaux à l’Inra.
Comment ça marche ?
La transgenèse permet de transférer du matériel génétique d’un organisme à l’autre, théoriquement quelque soit l’espèce. Elle permet aussi de modifier l’expression des gènes d’un organisme, en les inhibant, en les surexprimant, ou en modifiant la protéine exprimée.
On distingue actuellement la cisgenèse, cas particulier de la transgenèse, dans laquelle l'organisme reçoit un de ses propres gènes non altéré dans sa structure. Le transfert de gène dans ce cas ne fait qu'augmenter le nombre de copies d'un gène et partant ses effets phénotypiques.

 Les étapes de la transgénèse :

1- Transfert du gène

Le gène à transférer est isolé et intégré dans un vecteur, souvent un plasmide bactérien, qui peut être aisément multiplié dans les bactéries.

Pour transférer cette construction dans la cellule végétale, il existe plusieurs techniques :- soit un transfert direct dans des protoplastes végétaux (cellules végétales débarrassées de leur paroi), en appliquant un choc électrique ou bien utilisant un polymère : le PEG, deux moyens qui permettent la pénétration de la construction dans le protoplaste ;- soit un transfert direct dans des cellules végétales dont la paroi est intacte : il faut alors utiliser un canon à particules qui envoie sur les tissus végétaux des billes de tungstène ou d'or portant l'ADN à transférer ;- soit la transformation par la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie possède naturellement un plasmide particulier capable de transférer de l'ADN bactérien dans le génome de la cellule végétale. On "domestique" ce système naturel de transfert en insérant le gène à transférer dans ce plasmide. La transformation se fait en immergeant des tissus végétaux (disques foliaires ou plantes entières en fleurs) dans une solution d'Agrobacterium tumefaciens sur son plasmide portant le gène d'intérêt.

Après transfert du gène par l'une de ces méthodes, on obtient donc, suivant les cas, des protoplastes, des tissus végétaux ou des plantes entières (dont on recueille les graines) qui ont intégré dans leur génome le gène à transférer, que l'on appelle dès lors "transgène". Pour sélectionner les plantes transformées, la construction porte un gène de sélection (gène de résistance à un herbicide ou à un antibiotique qui est éliminé par la suite) qui accompagne le gène à transférer.

Schéma de transfert du gène doc - 60.00 KB

2- Analyse des plantes transformées et création de variétés transgéniques

L'insertion du transgène dans le génome de la plante se fait de manière aléatoire. Chaque événement de transfert est particulier et il convient de le caractériser précisément a posteriori au niveau moléculaire. L'ADN de chaque transformant est donc analysé.D'autre part, chaque transformant est étudié pour ses propriétés agronomiques afin de vérifier que le gène transféré est correctement exprimé et confère à la plante les propriétés recherchées sans altérer les autres. Une fois cette plante de laboratoire obtenue, on la croise avec une lignée commerciale choisie selon ses caractères agronomiques, de manière à transférer le "transgène" dans cette variété. On se trouve là dans un schéma classique d'introgression d'un gène, qui se fait par croisement successifs avec la lignée commerciale, jusqu'à obtenir une plante ayant toutes les caractéristiques de cette lignée + celles apportées par le transgène...

Création de variétés transgéniques doc - 58.00 KB

Voir le dossier Les biotechnologies vertes

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Les biotechnologies vertes reposent sur un vaste ensemble de techniques de recherche en biologie végétale, techniques de culture in vitro ou techniques moléculaires telles que mutation, transgénèse, etc., dont ce dossier donne un panorama.